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    科研豬AMH酶聯免疫ELISA檢測試劑盒操作步驟

    發布時間:2018-06-11   點擊次數:1781次

    本試劑僅供研究使用       目的:本試劑盒用于測定豬血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中繆勒管抑制物質;抗繆勒管激素(MIS;AMH)的含量。

     

    實驗原理

    本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本豬繆勒管抑制物質;抗繆勒管激素(MIS;AMH)水平。用純化的豬繆勒管抑制物質;抗繆勒管激素(MIS;AMH)捕獲抗體包被微孔板,制成固相體,往包被的微孔中依次加入豬繆勒管抑制物質;抗繆勒管激素(MIS;AMH),再與HRP標記的檢測抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的豬繆勒管抑制物質;抗繆勒管激素(MIS;AMH)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品豬繆勒管抑制物質;抗繆勒管激素(MIS;AMH)含量。

     

    試劑盒組成

    試劑盒組成

    48孔配置

    96孔配置

    保存

    說明書

    1份

    1份

     

    封板膜

    2片

    2片

     

    密封袋

    1個

    1個

     

    酶標包被板

    1×48

    1×96

    2-8℃保存

    標準品

    0.3ml×6管

    0.3ml×6管

    2-8℃保存

    酶標試劑

    5 ml×1瓶

    10 ml×1瓶

    2-8℃保存

    樣品稀釋液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    顯色劑A液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    顯色劑B液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    終止液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    20×濃縮洗滌液

    15ml×1瓶

    25ml×1瓶

    2-8℃保存

    注:標準品濃度依次為:8、4、2、1、0.5、0 ng/mL.

     

    樣本處理及要求

    1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。

    2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。

    3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

    4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

    5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

    6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但避免反復凍融.

    7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

     

    操作步驟

    • 標準品的加樣:設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;。
    • 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
    • 加酶:每孔加入酶標試劑100μl,空白孔除外。
    • 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
    • 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
    • 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。
    • 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘. 
    • 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
    • 測定:以空白孔調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

     

    計算

    以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,    

    在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD      

    值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋      

    倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標      

    準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值      

    代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋      

    倍數,即為樣品的實際濃度。                  

     

                                                  

     

    (此圖僅供參考)

     

     

     

    試劑盒性能:

    1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。

    2.批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。

     

    檢測范圍:                                              

    0.25 ng/mL - 8 ng/mL

     

    靈敏度:                                              

    zui低檢測濃度小于0.1 ng/mL

     

    保存條件及有效期:

    1.試劑盒保存: 2-8。

    2.有效期: 6個月

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